CD73 CRISPR Activationプラスミド (m): sc-423919-ACT

マウスのNt5eは、CD73（ecto-5′-ヌクレオチダーゼ）をコードしており、細胞表面にGPIアンカーで結合する酵素です。CD73は細胞外AMPをアデノシンに加水分解し、プリン作動性シグナル伝達を形成するとともに、炎症促進性のATP/AMPシグナルと、アデノシンによる免疫調節とのバランスを制御します。CD73の活性は、アデノシン受容体経路およびcAMPに連動したシグナル伝達を介して、血管および上皮バリア機能、白血球の遊走、ならびに組織保護プログラムに影響を与えます。腫瘍微小環境や慢性炎症組織では、CD39–CD73軸が代謝性の免疫抑制、間質リモデリングの変化、抗腫瘍免疫の低下に寄与し得るため、Nt5eはがん生物学、自己免疫、線維化の研究でしばしば注目されます。また、表面エクト酵素としてのCD73は、細胞状態の遷移や、免疫細胞・内皮細胞の表現型に対する微小環境制御を解析するための指標としても用いられます。

CD73 CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Nt5eの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

CD73 CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Nt5e 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はNt5e転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性CD73の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のNt5e遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるCD73依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびNt5e発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるCD73経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。