Plásmido CRISPR de Activación (h) CCDC111: sc-404310-ACT

PRIMPOL (también conocido como CCDC111) codifica PrimPol, una primasa–polimerasa que permite el reinicio de la replicación y la tolerancia al daño del ADN cuando las horquillas de replicación encuentran lesiones o estructuras secundarias del ADN. PrimPol favorece el recebado (repriming) aguas abajo de horquillas detenidas y contribuye al relleno de brechas posreplicativas, lo que vincula su actividad con vías de mantenimiento del genoma que se solapan con las respuestas al estrés replicativo dependientes de ATR. La alteración de la función de PRIMPOL se ha asociado con un aumento de la mutagénesis y de la sensibilidad al estrés genotóxico, lo que lo hace relevante para estudios sobre la fidelidad de la replicación y las respuestas celulares al daño del ADN endógeno y exógeno. Como enzima nuclear que actúa en horquillas de replicación sometidas a desafío, PRIMPOL se examina con frecuencia en el contexto del estrés replicativo, la estabilidad de la horquilla y el mantenimiento de la integridad cromosómica.

CCDC111 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PRIMPOL sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CCDC111 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PRIMPOL en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PRIMPOL, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CCDC111. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PRIMPOL y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CCDC111 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CCDC111 en células tumorales con expresión de PRIMPOL silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.