cathepsin D Double Nickaseプラスミド (h): sc-400207-NIC

CTSDはカテプシンDをコードしている。カテプシンDはリソソームに局在するアスパラギン酸エンドペプチダーゼで、エンドサイトーシスやオートファジーによって取り込まれた基質の一括的・選択的なタンパク質分解を担い、リソソーム恒常性の維持および細胞内の栄養リサイクルを支える。カテプシンDは、エンドソーム‐リソソーム系の成熟、抗原プロセシング、取り込み後の細胞外マトリックス成分の分解にも関与し、CTSD活性をプロテオスタシス、オートファジー‐リソソーム機能、ならびにストレス応答と結び付けている。CTSDの発現や細胞内輸送の破綻は、リソソームの完全性の変化、神経変性過程、腫瘍に伴う微小環境リモデリングと関連づけられており、細胞生存や炎症性シグナル伝達の研究において重要である。そのためヒトCTSDは、培養細胞におけるリソソーム依存性経路やプロテアーゼ駆動性表現型を解析するためのモデル遺伝子として広く用いられている。

cathepsin D ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における CTSD 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、CTSD内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、CTSDの機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、CTSDが破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。