CAR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418548-ACT

CXADR codifica il recettore del coxsackievirus e dell’adenovirus (CAR), una molecola di adesione della superfamiglia delle immunoglobuline arricchita nelle giunzioni serrate, dove contribuisce all’organizzazione della barriera epiteliale e ai contatti intercellulari. CAR partecipa all’assemblaggio delle giunzioni e a processi di segnalazione legati al rimodellamento del citoscheletro e alla polarità cellulare, influenzando la comunicazione cellula–cellula e l’architettura tissutale. Alterazioni dell’espressione e della localizzazione di CXADR sono state associate a cambiamenti dell’integrità epiteliale, dei programmi di sviluppo e a fenotipi associati ai tumori, come adesione disregolata e maggiore invasività. In quanto fattore di attacco virale, CAR è rilevante anche per gli studi sulle interazioni ospite–patogeno e sui meccanismi di ingresso virale nelle cellule umane.

CAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CXADR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CXADR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CXADR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CAR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CXADR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CAR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CAR nelle cellule tumorali con espressione di CXADR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.