Calpastatin CRISPR Activationプラスミド (m): sc-419474-ACT

マウスCastは、カルシウム依存性のカルパインプロテアーゼを内在性に阻害する因子であるカルパスタチンをコードしており、細胞骨格やシグナル伝達基質の限定的なプロテオリシス（部分分解）を抑制します。カルパイン活性を調節することで、カルパスタチンは細胞骨格リモデリング、フォーカルアドヒージョンのターンオーバー、膜輸送、アポトーシスの制御に寄与し、その下流で炎症シグナルやストレス応答にも影響を及ぼします。CAST–カルパインのバランスは、筋肉および神経系における組織の恒常性に広く重要であり、その破綻は文献上、ミオパチー、神経変性、免疫細胞活性化の変化といった機序に関連づけられています。細胞および動物モデルでは、Cast発現の操作が、プロテアーゼ駆動のリモデリングプログラムやカルシウム依存性シグナル伝達ネットワークを解析するために用いられます。

Calpastatin CRISPR活性化プラスミド（m）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性Castの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Calpastatin CRISPR 活性化プラスミド (m) は、ヒト細胞株における Cast 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はCast転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Calpastatinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のCast遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるCalpastatin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびCast発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるCalpastatin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。