C9orf41 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409368-ACT

CARNMT1 codifica a proteína humana C9orf41, uma metiltransferase dependente de S-adenosil-L-metionina implicada no metabolismo de RNA por meio da metilação da adenosina adjacente ao “cap” (Am), formando N6,2′-O-dimetiladenosina (m6Am) na extremidade 5′ de transcritos selecionados. Essa modificação epitranscritômica pode influenciar a estabilidade do mRNA e a eficiência de tradução, ligando a atividade de C9orf41 à regulação gênica pós-transcricional e à proteostase. Alterações na metilação associada ao “cap” de RNA e a desregulação de vias de processamento de RNA são características recorrentes em diversos conjuntos de dados de câncer e de doenças neurológicas, tornando CARNMT1 um nó útil para estudos mecanísticos do acoplamento entre transcrição e tradução. A modulação da expressão de C9orf41 permite investigar como a dinâmica de m6Am molda transições de estado celular, respostas ao estresse e programas de expressão gênica específicos de vias.

C9orf41 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CARNMT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

C9orf41 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CARNMT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CARNMT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de C9orf41. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CARNMT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de C9orf41 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via C9orf41 em células tumorais com expressão de CARNMT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.