brevican Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402668-ACT

BCAN codifica la brevican, un proteoglicano a solfato di condroitina arricchito nella matrice extracellulare cerebrale e nelle reti perineuronali, dove modula le interazioni cellula–matrice e la plasticità strutturale delle sinapsi. La brevican si lega all’acido ialuronico e si associa a tenascina-R e ad altri costituenti della matrice, influenzando l’assemblaggio della matrice extracellulare, l’adesione neuronale e la crescita dei neuriti. Attraverso la regolazione dell’organizzazione della matrice pericellulare e il rimodellamento sensibile alle proteasi, BCAN contribuisce a processi legati al neurosviluppo e al raffinamento dei circuiti dipendente dall’attività. Alterazioni nell’espressione e nella proteolisi della brevican sono state riportate in contesti neurologici e neuropsichiatrici e vengono spesso valutate come fattore associato alla matrice nella biologia dei gliomi e nei fenotipi invasivi.

brevican Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BCAN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

brevican Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BCAN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BCAN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di brevican. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BCAN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da brevican nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via brevican nelle cellule tumorali con espressione di BCAN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.