Plásmido CRISPR de Activación (m) Autotaxin: sc-422180-ACT

Enpp2 codifica la autotaxina, una lisofosfolipasa D secretada que convierte la lisofosfatidilcolina en ácido lisofosfatídico (LPA), un potente mediador lipídico que señaliza a través de GPCR para regular la migración celular, la proliferación, la supervivencia y la dinámica del citoesqueleto. La producción de LPA impulsada por la autotaxina moldea la señalización extracelular en los compartimentos vascular, inmunitario y estromal, influyendo en la angiogénesis, la inflamación y la remodelación de la matriz extracelular. En modelos de ratón, la actividad de Enpp2 se examina con frecuencia en contextos de lesión y reparación tisular, fibrosis, desregulación metabólica y fenotipos asociados al microambiente tumoral, donde la señalización por LPA puede reprogramar el estado celular y la motilidad. Su función enzimática también vincula el metabolismo lipídico con programas transcripcionales aguas abajo asociados a Rho/ROCK, MAPK/ERK, PI3K/AKT y YAP/TAZ.

Autotaxin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Enpp2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Autotaxin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Enpp2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Enpp2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Autotaxin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Enpp2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Autotaxin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Autotaxin en células tumorales con expresión de Enpp2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.