Plásmido CRISPR de Activación (h) ATP7A: sc-402387-ACT

ATP7A codifica una ATPasa de tipo P transportadora de cobre que regula la distribución intracelular de este metal al exportarlo desde el citosol y dirigirlo hacia la vía secretora para la metalación de las cuproenzimas. Al controlar el eflujo y el tráfico del cobre, ATP7A contribuye a la homeostasis redox, a las respuestas mitocondriales y al estrés oxidativo, y a la maduración enzimática dentro de la red de Golgi. La actividad desregulada de ATP7A altera el equilibrio del cobre e influye en procesos como la formación del tejido conectivo y la señalización del neurodesarrollo debido al deterioro de la función de las cuproenzimas. En consecuencia, ATP7A se estudia ampliamente en modelos de trastornos del metabolismo del cobre y de vías de estrés celular vinculadas a la actividad enzimática dependiente del cobre.

ATP7A El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP7A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ATP7A El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP7A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP7A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ATP7A. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP7A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ATP7A en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ATP7A en células tumorales con expresión de ATP7A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.