ATP6E Double Nickaseプラスミド (h): sc-404046-NIC

ATP6V1E1は、液胞型H⁺-ATPase（V-ATPase）のV1周辺ドメインを構成するE1サブユニット（ATP6E）をコードする。V-ATPaseは多数のサブユニットからなる回転型ATPaseで、プロトン輸送を駆動してエンドソームやリソソームなどの細胞内区画を酸性化する。オルガネラpHを制御することで、V-ATPase活性は受容体介在性エンドサイトーシス、リソソーム分解、オートファジー、抗原プロセシング、ならびに小胞輸送を調節し、膜輸送と連動した栄養感知やシグナル伝達経路にも下流で影響を及ぼす。V-ATPaseのサブユニット組成や機能が乱れると細胞恒常性が破綻し、酸性化異常に関わる遺伝性疾患や神経発達系の表現型、さらにはプロテオスタシスの変化や代謝ストレス応答の異常と関連することが示されている。したがってATP6V1E1は、ヒト細胞におけるpH依存的な膜動態とオルガネラ機能の制御を研究するうえで有用な遺伝子座である。

ATP6E ダブルニカースプラスミド（h）は、human 細胞株における ATP6V1E1 座の高特異性編集のために設計された、対となる2つのプラスミドから構成される。各プラスミドは、Cas9 D10Aニカースと、ATP6V1E1内の対向するDNA鎖を標的とする異なるsgRNAを発現する。対向するDNA鎖上の隣接する部位に誘導されると、2つのニカースはオフセットした一本鎖切断を生成し、これらが組み合わさってずれた二本鎖切断を生じさせる。これにより、両方のガイドによる協調的なオンターゲット活性が必要となる。生じたDNA切断は、細胞内の内在性修復経路、特に非相同末端結合（NHEJ）によって修復され、その結果、ATP6V1E1の機能を阻害する挿入または欠失が生じる。標的座標における2つのsgRNAの結合を必要とするこの二重ニッキング法は、編集の特異性を高め、標的精度に対するさらなる制御が求められる用途において、CRISPR戦略を補完するものである。

編集された細胞を効率的に同定するために、1つのプラスミドはトランスフェクトされた細胞集団を蛍光可視化するためのGFPをコードし、もう1つのプラスミドは抗生物質選別用のプロマイシン耐性遺伝子を保有しています。これらの機能により、共トランスフェクトされた細胞集団の効率的な濃縮が可能となり、ATP6V1E1が破壊されたクローンの検証が簡素化されます。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。