Asbt Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402666-ACT

O gene humano SLC10A2 codifica o transportador apical de ácidos biliares dependente de sódio (Asbt), um simportador de membrana que medeia a captação ativa de ácidos biliares conjugados no íleo distal e contribui para a reciclagem entero-hepática de ácidos biliares. Ao regular o tamanho do pool de ácidos biliares e a absorção intestinal, o Asbt influencia a sinalização de ácidos biliares via FXR, o metabolismo de lipídios e programas metabólicos e inflamatórios a jusante. Alterações na atividade de SLC10A2 estão associadas a fenótipos de má absorção de ácidos biliares, diarreia e desregulação da homeostase de colesterol e de ácidos biliares, sendo frequentemente estudado no contexto da fisiologia do transporte no epitélio intestinal. Esse transportador também é relevante para investigações sobre a sinalização do eixo intestino–fígado e sobre o impacto dos ácidos biliares em processos metabólicos associados ao microbioma.

Asbt O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC10A2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Asbt O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC10A2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC10A2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Asbt. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC10A2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Asbt no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Asbt em células tumorais com expressão de SLC10A2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.