ART1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403742-ACT

O ART1 humano codifica a ecto-ADP-ribosiltransferase 1, uma enzima ancorada à superfície celular por GPI que catalisa a mono-ADP-ribosilação de proteínas extracelulares e associadas à membrana, usando NAD+ como substrato. Essa modificação pós-traducional pode alterar a função de receptores, a adesão e a sinalização relacionada ao sistema imune na interface celular, vinculando o ART1 à regulação da comunicação celular e das respostas ao estresse. A atividade do ART1 tem sido estudada no contexto de microambientes inflamatórios e de fenótipos associados ao câncer, nos quais mudanças na ADP-ribosilação da superfície celular podem influenciar as interações entre tumor e sistema imune e o comportamento metastático. Como mediador da sinalização extracelular dependente de NAD+, o ART1 oferece um ponto de entrada acessível para investigar como a ADP-ribosilação molda o crosstalk entre vias em células humanas.

ART1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ART1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ART1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ART1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ART1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ART1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ART1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ART1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ART1 em células tumorais com expressão de ART1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.