ACSVL4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402011-ACT

SLC27A4 codifica ACSVL4 (FATP4), una sintetasi degli acil-CoA per acidi grassi a catena molto lunga che accoppia l’assorbimento di acidi grassi a catena lunga e molto lunga alla loro attivazione intracellulare, convogliando così i lipidi verso la β-ossidazione, la biosintesi di lipidi complessi e il rimodellamento delle membrane. Generando acil-CoA di acidi grassi, ACSVL4 influenza l’omeostasi lipidica dell’epitelio e i processi associati alla barriera, intersecandosi con programmi metabolici che regolano le risposte cellulari allo stress e la differenziazione. Un’attività deregolata di SLC27A4 è stata collegata a difetti nell’elaborazione dei lipidi epidermici e a un’alterata gestione degli acidi grassi, rendendolo rilevante per studi sulla biologia della pelle, sul metabolismo lipidico e sulla riprogrammazione metabolica in contesti associati a patologie.

ACSVL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC27A4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ACSVL4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC27A4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC27A4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ACSVL4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC27A4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ACSVL4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ACSVL4 nelle cellule tumorali con espressione di SLC27A4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.