ABHD5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402273-ACT

ABHD5 umano (noto anche come CGI-58) codifica un coattivatore associato alle goccioline lipidiche che collega la mobilizzazione dei lipidi neutri all’equilibrio energetico cellulare stimolando l’attività della lipasi dei trigliceridi del tessuto adiposo (ATGL) e promuovendo l’idrolisi dei triacilgliceroli. Attraverso la regolazione del turnover delle goccioline lipidiche, del flusso di acidi grassi e della successiva β-ossidazione mitocondriale, ABHD5 contribuisce a coordinare l’omeostasi metabolica e la segnalazione lipidica. L’alterazione della funzione di ABHD5 è associata a un accumulo lipidico anomalo e a deposizione ectopica di lipidi, collegando questa via a fenotipi ereditari di accumulo di lipidi neutri e a meccanismi più ampi di malattia metabolica. In contesti tumorali e infiammatori, le modifiche del metabolismo lipidico e della dinamica delle goccioline lipidiche influenzate da ABHD5 possono rimodellare la composizione delle membrane e le risposte allo stress, rendendolo rilevante per la mappatura di pathway in diversi sistemi modello.

ABHD5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABHD5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ABHD5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABHD5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABHD5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ABHD5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABHD5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ABHD5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ABHD5 nelle cellule tumorali con espressione di ABHD5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.