5-LO Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401239-ACT

O ALOX5 humano codifica a 5-lipoxigenase (5-LO), uma dioxigenase de ferro não heme que catalisa a conversão do ácido araquidônico em intermediários de leucotrienos, incluindo 5-HPETE e o leucotrieno A4. Essa etapa enzimática está no cerne da biossíntese de leucotrienos e coordena a sinalização de mediadores lipídicos inflamatórios por vias autócrinas e parácrinas em células mieloides e outras populações de leucócitos. A atividade da 5-LO se integra à comunicação cruzada na rede de eicosanoides, à ativação dependente de cálcio e às dinâmicas de localização subcelular que moldam respostas downstream de citocinas e quimiotaxia. A desregulação da sinalização ALOX5/5-LO tem sido associada à biologia de doenças inflamatórias e à remodelação do microambiente imune, tornando-a um ponto relevante para estudos mecanísticos de imunometabolismo e sinalização lipídica.

5-LO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALOX5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

5-LO O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALOX5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALOX5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 5-LO. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALOX5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 5-LO no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 5-LO em células tumorais com expressão de ALOX5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.