20S Proteasome β3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409667-ACT

PSMB3 codifica a subunidade β3 do núcleo catalítico do proteassoma humano 20S, um componente estrutural do proteassoma 26S que permite a degradação, dependente de ATP, de proteínas ubiquitinadas. A proteólise mediada pelo proteassoma regula o controle de qualidade proteica, o processamento de antígenos e a progressão do ciclo celular, e interage com vias que controlam respostas ao estresse, sinalização de dano ao DNA e atividade do NF-κB. Alterações na expressão de subunidades do proteassoma podem remodelar a proteostase e modificar a degradação de proteínas regulatórias de curta meia-vida, influenciando apoptose, proliferação e sinalização imune. A função desregulada do proteassoma e a composição alterada de suas subunidades têm sido associadas à biologia do câncer, à neurodegeneração e à fisiopatologia inflamatória, por meio de efeitos amplos sobre a homeostase proteica.

20S Proteasome β3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PSMB3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

20S Proteasome β3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PSMB3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PSMB3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 20S Proteasome β3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PSMB3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 20S Proteasome β3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 20S Proteasome β3 em células tumorais com expressão de PSMB3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.