βB2-crystallin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403626-ACT

CRYBB2 kodiert βB2‑Krystallin, einen wesentlichen strukturellen Bestandteil der Wirbeltieraugenlinse, der zur Assemblierung von Krystallin‑Komplexen, zur Aufrechterhaltung des Brechungsindex und zur langfristigen Linsentransparenz beiträgt. Als stark exprimiertes und ungewöhnlich stabiles Protein unterstützt βB2‑Krystallin die Proteostase in Linsenfaserzellen und hilft, Proteinaggregation während Reifung und Alterung zu begrenzen. Eine veränderte CRYBB2‑Expression oder Fehlfaltung von Krystallinen wird mit einer gestörten Linsenarchitektur in Verbindung gebracht und häufig im Kontext der Kataraktentstehung und anderer Phänotypen der Linsentrübung untersucht. Da Linsenfaserzellen arm an Organellen sind und auf langlebige Proteinnetzwerke angewiesen sind, dient CRYBB2 als Modell zur Untersuchung von Chaperon‑Interaktionen, Antworten auf Redoxstress und Proteinstrukturerhalt unter Bedingungen hoher molekularer Enge.

βB2-crystallin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRYBB2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

βB2-crystallin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRYBB2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRYBB2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen βB2-crystallin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRYBB2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von βB2-crystallin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des βB2-crystallin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRYBB2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.