αENaC Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422825-ACT

Scnn1a codifica a subunidade alfa do canal epitelial de sódio murino (αENaC), um componente formador de poro necessário para o transporte de Na⁺ sensível à amilorida através de membranas epiteliais. A αENaC contribui para a captação apical de sódio que influencia a homeostase do líquido de superfície das vias aéreas, a depuração do fluido alveolar e o equilíbrio eletrolítico transepitelial no rim, pulmão e cólon distal. A atividade do canal integra-se com a sinalização da aldosterona e com a abertura dependente de proteases, e é modulada por vias de tráfego dependentes de ubiquitina, como a regulação mediada por NEDD4-2. A disfunção do ENaC é amplamente utilizada como modelo de alterações no manuseio de sal e água, associando a expressão de Scnn1a a estudos de desidratação das vias aéreas, fenótipos de obstrução por muco e fisiologia relacionada à pressão arterial, in vivo e em epitélios cultivados.

αENaC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Scnn1a sem alterar a sequência de ADN subjacente.

αENaC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Scnn1a em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Scnn1a, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de αENaC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Scnn1a nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de αENaC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via αENaC em células tumorais com expressão de Scnn1a silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.