αENaC Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401123-ACT

SCNN1A codifica a subunidade alfa do canal epitelial de sódio (αENaC), um determinante-chave da entrada apical de Na⁺ em epitélios polarizados. Em conjunto com as subunidades β e γ do ENaC, a αENaC sustenta a absorção transepitelial de sódio e o subsequente movimento osmótico de água, influenciando a homeostase do líquido de superfície das vias aéreas, o manuseio renal de sódio e a fisiologia da barreira epitelial. A atividade do ENaC é rigidamente regulada por processamento proteolítico e por renovação dependente de ubiquitina via a via NEDD4L, integrando sinais da sinalização da aldosterona/receptor mineralocorticoide (MR) e da composição lipídica da membrana. Alterações na expressão de SCNN1A ou na regulação do ENaC estão associadas a distúrbios do equilíbrio de sal e fluidos, incluindo fenótipos de desidratação das vias aéreas relacionados à fibrose cística e síndromes monogênicas que afetam a regulação da pressão arterial.

αENaC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SCNN1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

αENaC O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SCNN1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SCNN1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de αENaC. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SCNN1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de αENaC no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via αENaC em células tumorais com expressão de SCNN1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.