XPA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401483-ACT

L’XPA umano codifica un fattore chiave di riconoscimento del danno al DNA nella via di riparazione per escissione di nucleotidi (NER), che verifica le lesioni che deformano la doppia elica e coordina il reclutamento di TFIIH, RPA ed ERCC1–XPF per consentire la doppia incisione e la sintesi di riparazione. Agendo da impalcatura per i complessi di riparazione in corrispondenza di fotoprodotti indotti dai raggi UV e di ingombranti addotti chimici, XPA contribuisce a preservare l’integrità del genoma durante replicazione e trascrizione. L’alterazione o la riduzione dell’attività di XPA compromette la capacità della NER, aumentando il carico mutazionale e la sensibilità cellulare allo stress genotossico. La disfunzione di XPA è associata allo xeroderma pigmentoso di gruppo A ed è spesso sfruttata negli studi su deficit di riparazione del DNA, mutagenesi e segnalazione della risposta allo stress.

XPA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di XPA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

XPA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus XPA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione XPA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di XPA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus XPA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da XPA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via XPA nelle cellule tumorali con espressione di XPA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.