XAF1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402427-ACT

XAF1 (XIAP-associated factor 1) è un oncosoppressore pro-apoptotico che antagonizza le proteine inibitrici dell’apoptosi, inclusa XIAP, facilitando l’attivazione delle caspasi e l’apoptosi mitocondriale. La sua espressione è spesso indotta dalla segnalazione dell’interferone e dallo stress cellulare, collegando XAF1 alle risposte immunitarie innate e a programmi trascrizionali che limitano la sopravvivenza in condizioni dannose. Una ridotta espressione di XAF1, dovuta a ipermetilazione del promotore o a repressione trascrizionale, è stata riportata in molteplici neoplasie ed è spesso associata a resistenza all’apoptosi e a una sensibilità alterata alle vie di risposta allo stress. In quanto regolatore delle decisioni sul destino cellulare, XAF1 è ampiamente studiato nei contesti del controllo del ciclo cellulare, delle risposte al danno al DNA e del cross-talk con la segnalazione infiammatoria.

XAF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di XAF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

XAF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus XAF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione XAF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di XAF1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus XAF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da XAF1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via XAF1 nelle cellule tumorali con espressione di XAF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.