WTX CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-409039-ACT-2

Das humane AMER1-Gen kodiert das WTX-Protein, einen mit Tumorsuppressorfunktionen assoziierten Faktor, der das kanonische Wnt/β‑Catenin-Signalweg reguliert, indem er den Abbau von β‑Catenin fördert und Komponenten des Destruktionskomplexes koordiniert. WTX ist zudem an der Organisation des Zytoskeletts sowie an Zell‑Zell‑Adhäsionsprozessen beteiligt und verknüpft membranassoziierte Gerüststrukturen mit der transkriptionellen Kontrolle von Entwicklungsprogrammen. Funktionsverlustveränderungen in AMER1 werden mit dem Wilms-Tumor und der Osteopathia striata mit kranialer Sklerose in Verbindung gebracht; außerdem wurde eine Störung von AMER1 in weiteren Krebskontexten beobachtet, in denen eine Fehlregulation des Wnt-Signalwegs eine abnorme Proliferation antreibt. Werkzeuge zur Geneditierung und funktionellen Perturbation von AMER1/WTX ermöglichen mechanistische Studien zur Wnt-abhängigen Transkription, zur Entwicklungssignalgebung sowie zu Genotyp‑Phänotyp‑Beziehungen in renalen und skelettalen Modellsystemen.

WTX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AMER1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WTX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AMER1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AMER1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WTX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AMER1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WTX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WTX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AMER1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.