WTX Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-409039-ACT-2

O AMER1 humano codifica a proteína WTX, um fator associado à supressão tumoral que regula a sinalização canônica Wnt/β-catenina ao promover a degradação (turnover) da β-catenina e coordenar componentes do complexo de destruição. A WTX também participa da organização do citoesqueleto e de processos de adesão célula–célula, conectando a estrutura de suporte associada à membrana ao controle transcricional de programas de desenvolvimento. Alterações de perda de função em AMER1 estão implicadas no tumor de Wilms e na osteopatia estriada com esclerose craniana, e a desregulação de AMER1 foi observada em outros contextos de câncer em que a desregulação da via Wnt impulsiona proliferação aberrante. Ferramentas de edição gênica e de perturbação funcional de AMER1/WTX dão suporte a estudos mecanísticos da transcrição dependente de Wnt, da sinalização do desenvolvimento e das relações genótipo–fenótipo em sistemas modelo renais e esqueléticos.

WTX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AMER1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

WTX O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AMER1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AMER1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de WTX. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AMER1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de WTX no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via WTX em células tumorais com expressão de AMER1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.