VPS4B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403260-ACT

VPS4B codifica uma ATPase AAA+ que impulsiona a desmontagem e a reciclagem do ESCRT-III, uma etapa fundamental na triagem endossomal, na biogênese de corpos multivesiculares e na degradação lisossomal de proteínas de membrana. Ao coordenar eventos de remodelação de membranas, a VPS4B contribui para a downregulation de receptores, a citocinese, o reparo da membrana plasmática e o brotamento de certos vírus envelopados. A perturbação da dinâmica ESCRT–VPS4 pode alterar o tráfego de cargas e as saídas de sinalização, ligando vias associadas à VPS4B à homeostase celular e a respostas ao estresse relevantes para a biologia de diversas doenças. Como regulador central do transporte mediado por vesículas, a VPS4B é frequentemente estudada no contexto de proteostase, integridade de membrana e redes de sinalização dependentes de tráfego.

VPS4B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS4B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS4B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS4B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS4B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS4B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS4B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS4B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS4B em células tumorais com expressão de VPS4B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.