VPS16 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-403914-ACT

ヒトVPS16は、エンドソームとリソソームの膜融合イベントを協調させるCORVET/HOPSテザリング複合体の中核サブユニットをコードしている。VPS16はRab GTPアーゼやSNARE装置との相互作用を介して、エンドリソソーム輸送、カーゴの選別、オートファゴソーム–リソソーム融合を支え、これらは細胞のプロテオスタシスや受容体ターンオーバーの維持において中心的な過程である。これらの経路が攪乱されると、シグナル伝達恒常性の変化や、リソソーム機能不全に関連する神経発達疾患および神経変性疾患の機序と結び付くことが示されている。そのためVPS16は、ヒト細胞モデルにおける小胞テザリング、リソソーム生合成、ストレス応答性オートファジーを研究するための分子学的ハンドルとして広く用いられている。

VPS16 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性VPS16の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

VPS16 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における VPS16 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はVPS16転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性VPS16の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のVPS16遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるVPS16依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびVPS16発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるVPS16経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。