VAP-A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403093-ACT

VAPA kodiert das vesikelassoziierte Membranprotein‑assoziierte Protein A (VAP‑A), einen im ER lokalisierten Adapter, der Membrankontaktstellen organisiert und den Lipidaustausch, den Vesikeltransport sowie die Kommunikation zwischen Organellen koordiniert. VAP‑A bindet Partnerproteine mit FFAT‑Motiv, um die Homöostase von Phosphoinositiden und Sterolen zu regulieren, und unterstützt damit den ER‑Golgi‑Transport, die Endosomendynamik und die Signalübertragung zwischen ER und Mitochondrien. Über diese Prozesse beeinflusst VAP‑A die Proteostase, Autophagie und Stressantworten, die den zellulären Stoffwechsel und das Überleben mitbestimmen. Eine Fehlregulation der mit VAPA verknüpften Kontaktstellen‑Biologie wird mit Neurodegeneration und anderen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die mit gestörter Lipidverarbeitung und ER‑Stress einhergehen, wodurch VAPA ein geeigneter Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Membranorganisation ist.

VAP-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VAPA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VAP-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VAPA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VAPA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VAP-A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VAPA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VAP-A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VAP-A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VAPA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.