VAChT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401240-ACT

SLC18A3 codifica il trasportatore vescicolare dell’acetilcolina (VAChT), una proteina di membrana delle vescicole sinaptiche che impacchetta l’acetilcolina citosolica in vescicole secretorie nei neuroni colinergici e in altri tipi cellulari colinergici. Fornendo acetilcolina vescicolare per l’esocitosi regolata, VAChT è essenziale per la trasmissione sinaptica alle giunzioni neuromuscolari e in tutto il sistema nervoso autonomo e centrale, influenzando l’accoppiamento eccitazione–contrazione e l’attività dei circuiti neuronali. La funzione di VAChT è strettamente collegata al metabolismo dell’acetilcolina e alle vie di riciclo delle vescicole, inclusa la coordinazione con la sintesi dipendente dalla colina acetiltransferasi e con il macchinario di traffico vescicolare. Alterazioni della segnalazione colinergica e una disregolazione del rilascio di acetilcolina sono implicate in molteplici contesti neurobiologici, rendendo SLC18A3 un bersaglio utile per studiare i meccanismi alla base della disfunzione colinergica in modelli rilevanti per la malattia.

VAChT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC18A3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VAChT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC18A3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC18A3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VAChT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC18A3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VAChT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VAChT nelle cellule tumorali con espressione di SLC18A3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.