USP45 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-429548-ACT-2

O gene Usp45 de camundongo codifica a USP45, uma protease específica de ubiquitina que remove modificações de ubiquitina de proteínas-alvo para regular sua estabilidade e a saída de sinalização. A USP45 está implicada na resposta a danos no DNA, contribuindo para a manutenção do genoma por meio de eventos de desubiquitinação que influenciam a escolha da via de reparo e a tolerância ao estresse de replicação, incluindo a coordenação com redes de modificações pós-traducionais, como a sinalização por ubiquitina e SUMO. A interrupção da desubiquitinação mediada por USP45 pode perturbar processos de reparo associados à cromatina, aumentar a instabilidade genômica e tem sido relacionada a fenótipos relevantes para a biologia do câncer e a defeitos do desenvolvimento. Estudos de edição gênica direcionada a Usp45 e de genômica funcional em células de camundongo permitem a dissecação mecanística do circuito de reparo de DNA dependente de ubiquitina, a identificação de substratos e parceiros de interação da USP45 e a modelagem de relações genótipo–fenótipo em vias de integridade genômica.

USP45 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Usp45 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

USP45 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Usp45 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Usp45, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de USP45. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Usp45 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de USP45 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via USP45 em células tumorais com expressão de Usp45 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.