USP32 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-433591-ACT

Usp32 codifica a enzima desubiquitinante USP32, uma protease específica de ubiquitina que reverte a conjugação de ubiquitina para regular a estabilidade proteica, o tráfego intracelular e a transdução de sinal. Como parte do controle de qualidade dependente de ubiquitina, a USP32 está implicada no controle da proteostase e do turnover de componentes de vias que influenciam a progressão do ciclo celular, as respostas ao estresse e a sinalização associada à membrana. A desubiquitinação desregulada tem ampla relevância em oncologia e neurobiologia ao alterar a degradação de proteínas regulatórias e deslocar as saídas das vias de sinalização. Em sistemas de modelos murinos, a modulação da atividade de USP32 dá suporte a estudos mecanísticos de redes de sinalização por ubiquitina e de seus papéis em fenótipos celulares associados a doenças.

USP32 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Usp32 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

USP32 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Usp32 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Usp32, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de USP32. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Usp32 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de USP32 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via USP32 em células tumorais com expressão de Usp32 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.