UBC12 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403119-ACT

UBE2M codifica a enzima E2 conjugadora de neddilação UBC12, um componente central da via NEDD8 que ativa as ligases de ubiquitina do tipo cullin-RING (CRLs) por meio da neddilação de cullinas. Ao promover a atividade das CRLs, a UBC12 influencia a degradação dependente de ubiquitina de reguladores que controlam a progressão do ciclo celular, o licenciamento da replicação do DNA e a sinalização responsiva ao estresse, moldando assim a proteostase e o controle de checkpoints. A perturbação do circuito de neddilação tem sido associada à proliferação desregulada e a respostas alteradas ao estresse proteotóxico e genotóxico em múltiplos contextos de doença, tornando o UBE2M um ponto útil para o estudo de redes de modificações do tipo ubiquitina. A função da UBC12 humana também é relevante para investigações de vias de homeostase proteica que se cruzam com a sinalização inflamatória e programas transcricionais oncogênicos.

UBC12 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UBE2M sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UBC12 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UBE2M em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UBE2M, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UBC12. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UBE2M nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UBC12 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UBC12 em células tumorais com expressão de UBE2M silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.