Tyrosinase Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423566-ACT

O gene Tyr do camundongo codifica a tirosinase, uma oxidorredutase dependente de cobre que catalisa etapas-chave e limitantes da velocidade na biossíntese de eumelanina e feomelanina, incluindo a conversão de L-tirosina em DOPA e DOPAquinona. A atividade da tirosinase sustenta programas de diferenciação de melanócitos e conecta a melanogênese ao equilíbrio redox, à biogênese de melanossomos e à maturação dos grânulos de pigmento. Alterações na expressão de Tyr ou na função enzimática estão intimamente associadas a fenótipos de pigmentação e são frequentemente usadas como um marcador molecular em estudos de biologia de melanócitos e de regulação das vias de melanina. Por ser uma enzima restrita à linhagem e com saídas bioquímicas mensuráveis, a tirosinase oferece um ponto de investigação acessível para examinar redes de sinalização e respostas a estresse associadas ao pigmento.

Tyrosinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tyr sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Tyrosinase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tyr em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tyr, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Tyrosinase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tyr nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Tyrosinase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Tyrosinase em células tumorais com expressão de Tyr silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.