TTBK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403998-ACT

TTBK1 (Tau-Tubulin-Kinase 1) ist eine in Neuronen angereicherte Serin/Threonin-Kinase, die an der Regulation der Zytoskelettdynamik beteiligt ist, indem sie mikrotubuliassoziierte Proteine, einschließlich Tau, phosphoryliert und das Neuritenauswachsen moduliert. Sie ist mit Signalwegen verknüpft, die die Mikrotubuli-Stabilität, den axonalen Transport und die Proteostase steuern, und steht funktionell mit phosphorylierungsabhängigen Signalereignissen in Verbindung, die die neuronale Polarität und den Erhalt von Synapsen beeinflussen. Eine veränderte TTBK1-Aktivität wurde im Kontext der Biologie neurodegenerativer Erkrankungen untersucht, in denen eine fehlregulierte Tau-Phosphorylierung und ein Umbau des Zytoskeletts zentrale molekulare Merkmale sind. In humanen Zellmodellen hilft die gezielte Veränderung der TTBK1-Expression dabei, kinasegetriebene Netzwerkeffekte auf neuronale Stressantworten und die Zytoskelettorganisation zu untersuchen.

TTBK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TTBK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TTBK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TTBK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TTBK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TTBK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TTBK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TTBK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TTBK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TTBK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.