TRPM5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403223-ACT

O TRPM5 codifica um canal de cátions monovalentes ativado por cálcio, da família melastatina dos receptores de potencial transitório (TRP), que acopla sinais intracelulares de Ca2+ à despolarização da membrana. É um mediador-chave da transdução quimiossensorial em células receptoras do paladar e contribui para a amplificação de sinais a jusante das vias GPCR–PLCβ2–IP3–Ca2+, ao modular a excitabilidade elétrica. A atividade do TRPM5 influencia a secreção dependente de estímulo e a excitabilidade em contextos epiteliais e endócrinos específicos, conectando a dinâmica de Ca2+ a programas de resposta celular. Alterações na expressão do TRPM5 ou na função do canal têm sido investigadas em relação a fenótipos sensoriais e a estados mais amplos de sinalização metabólica e inflamatória em tecidos humanos.

TRPM5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TRPM5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TRPM5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TRPM5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TRPM5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TRPM5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TRPM5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TRPM5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TRPM5 em células tumorais com expressão de TRPM5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.