Transketolase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401941-ACT

O TKT humano codifica a transcetolase, uma enzima dependente de pirofosfato de tiamina que catalisa reações reversíveis de transferência de dois carbonos no ramo não oxidativo da via das pentoses fosfato. Ao interconverter ribose-5-fosfato e intermediários da glicólise, a transcetolase ajuda a coordenar a biossíntese de nucleotídeos, o equilíbrio redox por meio do acoplamento a reações produtoras de NADPH e o fluxo global de carbono durante a proliferação e o estresse metabólico. A atividade de TKT influencia as respostas celulares ao estresse oxidativo e à disponibilidade de nutrientes, e alterações na regulação da via das pentoses fosfato têm sido associadas ao remodelamento metabólico observado em diversos contextos de doença, incluindo biologia do câncer e distúrbios metabólicos hereditários. Como um nó central que conecta a glicólise ao metabolismo das pentoses, o TKT é frequentemente estudado em análises em nível de via relacionadas à demanda biossintética, à capacidade antioxidante e às transições de estado celular.

Transketolase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TKT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Transketolase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TKT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TKT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Transketolase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TKT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Transketolase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Transketolase em células tumorais com expressão de TKT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.