TMEM45A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412437-ACT

TMEM45A kodiert ein multipassiges Transmembranprotein, das an der epithelialen Differenzierung und der zellulären Anpassung an mikroenvironmentalen Stress beteiligt ist und Berichten zufolge in hypoxischen und keratinisierenden Geweben angereichert vorkommt. TMEM45A wurde mit der Regulation des Membrantransports und von Stressantwort-Programmen in Verbindung gebracht, die Proliferation, Überleben und barrierebezogene Prozesse beeinflussen. Transkriptionelle Veränderungen von TMEM45A wurden in mehreren Tumorarten beobachtet, was seine Nutzung als markerassoziiertes Gen in Studien zu hypoxiegetriebenem Remodeling und Therapieansprechwegen unterstützt. Als membranlokalisierter Faktor mit kontextabhängiger Expression wird TMEM45A häufig hinsichtlich seines Beitrags zur Plastizität von Tumorzellen und zur phänotypischen Heterogenität untersucht.

TMEM45A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMEM45A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TMEM45A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMEM45A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMEM45A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TMEM45A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMEM45A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TMEM45A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TMEM45A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMEM45A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.