TIM-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416365-ACT

HAVCR2 kodiert das T‑Zell‑Immunglobulin‑ und Muzin‑Domänen‑haltige Protein 3 (TIM‑3), einen Immuncheckpoint‑Rezeptor, der auf aktivierten T‑Zellen, regulatorischen T‑Zellen, NK‑Zellen und myeloischen Subpopulationen exprimiert wird. TIM‑3 moduliert Immunaktivierungs‑ und Erschöpfungsprogramme über ligandenabhängige Signalübertragung mit Galectin‑9, Phosphatidylserin, CEACAM1 und HMGB1 und beeinflusst dadurch TCR‑Signalierungsschwellen, Zytokinproduktion und angeborene Erkennung. Diese Prozesse greifen in entzündliche und tolerogene Signalwege ein, die antivirale Antworten, tumorassoziierte Immunflucht und myeloidvermittelte Immunregulation prägen. Eine veränderte TIM‑3‑Expression und ‑Signalgebung wurde in Zusammenhängen chronischer Infektion, Autoimmunität und krebsassoziierter Immundysfunktion beobachtet, was seinen Einsatz als mechanistischen Marker für die Umgestaltung von Immunzuständen unterstützt.

TIM-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HAVCR2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TIM-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HAVCR2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HAVCR2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TIM-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HAVCR2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TIM-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TIM-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HAVCR2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.