TIM-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416365-ACT

HAVCR2 codifica la proteina 3 contenente il dominio immunoglobulinico delle cellule T e il dominio mucinico (TIM-3), un recettore checkpoint immunitario espresso su cellule T attivate, cellule T regolatorie, cellule NK e sottopopolazioni mieloidi. TIM-3 modula i programmi di attivazione ed esaurimento immunitario tramite segnalazione ligando-dipendente con galectina-9, fosfatidilserina, CEACAM1 e HMGB1, influenzando le soglie di segnalazione del TCR, la produzione di citochine e il sensing innato. Questi processi si intersecano con vie infiammatorie e tolerogeniche che modellano le risposte antivirali, l’elusione immunitaria tumorale e l’immunoregolazione guidata dalle cellule mieloidi. Alterazioni dell’espressione e della segnalazione di TIM-3 sono state osservate in contesti di infezione cronica, autoimmunità e disfunzione immunitaria associata al cancro, supportandone l’uso come marcatore meccanicistico del rimodellamento dello stato immunitario.

TIM-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HAVCR2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIM-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HAVCR2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HAVCR2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIM-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HAVCR2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIM-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIM-3 nelle cellule tumorali con espressione di HAVCR2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.