TCP-1 α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402699-ACT

TCP1 codifica TCP-1 alfa, una subunità fondamentale del complesso citosolico di chaperonine contenente TCP1 (CCT/TRiC), che ripiega e stabilizza proteine con topologie complesse, incluse actina e tubulina. Regolando la proteostasi del citoscheletro, CCT sostiene la dinamica dei microtubuli e dell’actina, la progressione del ciclo cellulare e i processi di traffico collegati alle reti di proteostasi. La funzione di TCP-1 alfa si intreccia con le vie di risposta allo stress e di controllo qualità proteico, che determinano il modo in cui le cellule gestiscono clienti mal ripiegati o inclini all’aggregazione. Un’attività chaperoninica disregolata e un’espressione alterata di TCP1 sono state associate a fenotipi rilevanti per la crescita oncogenica, la neurodegenerazione e lo squilibrio della proteostasi, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici.

TCP-1 α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TCP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TCP-1 α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TCP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TCP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TCP-1 α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TCP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TCP-1 α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TCP-1 α nelle cellule tumorali con espressione di TCP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.