Plásmido CRISPR de Activación (h) SUR-1: sc-401540-ACT

ABCC8 codifica el receptor de sulfonilureas 1 (SUR-1), una subunidad reguladora de la subfamilia C de la familia de transportadores ABC (ATP-binding cassette) de los canales de potasio sensibles a ATP (KATP), que acoplan el estado energético celular con la excitabilidad de la membrana. En las células β pancreáticas, SUR-1 se asocia con KCNJ11 para controlar la apertura y el cierre (gating) del canal KATP, modulando la despolarización inducida por glucosa, la entrada de Ca2+ y la exocitosis de gránulos de insulina. Más allá de la señalización endocrina, los canales KATP que contienen SUR-1 contribuyen a la regulación electrofisiológica en tejidos excitables mediante la detección metabólica y la homeostasis iónica. La variación genética o la desregulación de ABCC8 se asocia con trastornos de la secreción de insulina y de la homeostasis de la glucosa, por lo que es un objetivo frecuente de estudios mecanísticos en modelos de enfermedades metabólicas.

SUR-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ABCC8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SUR-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ABCC8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ABCC8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SUR-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ABCC8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SUR-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SUR-1 en células tumorales con expresión de ABCC8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.