SUCLA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404356-ACT

SUCLA2 umano codifica la subunità beta della succinil‑CoA ligasi ATP‑formante, un enzima fondamentale della matrice mitocondriale del ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) che catalizza la conversione reversibile del succinil‑CoA in succinato con fosforilazione del nucleotide. Collegando il flusso del carbonio nel metabolismo ossidativo alla produzione di ATP/GTP, SUCLA2 sostiene la bioenergetica mitocondriale, l’anaplerosi e l’accoppiamento metabolico con vie quali la biosintesi dell’eme e il catabolismo degli amminoacidi. La disfunzione di SUCLA2 è associata a difetti nel mantenimento del DNA mitocondriale e a una fosforilazione ossidativa compromessa, contribuendo ai fenotipi neuromuscolari ed encefalomiopatici riportati nei contesti di malattia mitocondriale. In quanto nodo metabolico, SUCLA2 è spesso studiata in modelli di stress mitocondriale, squilibrio redox e processi cellulari dipendenti dall’energia.

SUCLA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SUCLA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SUCLA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SUCLA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SUCLA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SUCLA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SUCLA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SUCLA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SUCLA2 nelle cellule tumorali con espressione di SUCLA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.