SR-2A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401532-ACT

HTR2A codifica o receptor humano de serotonina 5-HT2A (SR-2A), um receptor acoplado à proteína G que se acopla principalmente a Gq/11 para estimular a sinalização da fosfolipase C, a produção de fosfatos de inositol, a mobilização intracelular de Ca2+ e cascatas downstream dependentes de PKC. A atividade do SR-2A intersecta vias como MAPK/ERK e outros programas transcricionais dependentes de atividade que moldam a excitabilidade neuronal, a plasticidade sináptica e a função dos circuitos corticais. No sistema nervoso central, a expressão de HTR2A e a dinâmica de sua sinalização são frequentemente estudadas em relação à integração de neurotransmissores e ao cross-talk entre receptores que influenciam estados de rede relevantes para o comportamento. Alterações na sinalização serotoninérgica envolvendo o SR-2A têm sido associadas na literatura à biologia de doenças neuropsiquiátricas, incluindo esquizofrenia, transtornos do humor e vias relacionadas à enxaqueca, o que sustenta seu uso como alvo mecanístico em modelos de neurociência celular e de sistemas.

SR-2A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HTR2A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SR-2A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HTR2A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HTR2A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SR-2A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HTR2A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SR-2A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SR-2A em células tumorais com expressão de HTR2A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.