SPRED1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402981-ACT

SPRED1 (proteína 1 contendo domínio EVH1 relacionada a sprouty) é um regulador negativo da sinalização de receptores tirosina-quinase que atenua a cascata RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK ao recrutar a neurofibromina (NF1) e limitar a ativação de ERK a jusante. Por meio desse papel inibitório, a SPRED1 ajuda a controlar a proliferação e a diferenciação celulares, bem como a responsividade a fatores de crescimento em múltiplos tecidos. A disrupção genética ou a redução da atividade de SPRED1 está associada à desregulação da sinalização MAPK e é implicada em distúrbios do neurodesenvolvimento cutâneo, como a síndrome de Legius, com relevância mais ampla para contextos em que uma saída aberrante da via RAS/MAPK altera fenótipos celulares. Portanto, a SPRED1 é um ponto útil para dissecar o controle por feedback e o ajuste fino da via na biologia dependente de MAPK.

SPRED1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPRED1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SPRED1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPRED1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPRED1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SPRED1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPRED1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SPRED1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SPRED1 em células tumorais com expressão de SPRED1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.