SPARC Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423101-ACT

Mouse Sparc codifica SPARC, una glicoproteina matricellulare secreta che modula l’organizzazione della matrice extracellulare (ECM), la deposizione di collagene e le interazioni cellula–matrice. SPARC regola adesione, migrazione e proliferazione plasmando la segnalazione delle integrine e la disponibilità dei fattori di crescita, influenzando processi quali riparazione delle ferite, angiogenesi e rimodellamento tissutale. È spesso collegata a vie che governano la fibrosi e le risposte stromali, e la sua disregolazione è associata ad alterazioni dell’omeostasi della ECM e a microambienti infiammatori. Queste proprietà rendono SPARC un nodo utile per studiare il comportamento delle cellule mesenchimali, il crosstalk di segnalazione guidato dalla ECM e la regolazione del microambiente in modelli rilevanti per la malattia.

SPARC Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Sparc senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SPARC Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Sparc nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Sparc, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SPARC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Sparc nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SPARC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SPARC nelle cellule tumorali con espressione di Sparc silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.