Six2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422957-ACT

Six2 (sine oculis homeobox homolog 2) é um fator de transcrição homeobox que regula a manutenção de células progenitoras e a especificação de linhagens durante a organogênese em camundongos, com papéis bem definidos na autorrenovação de progenitores de néfrons e na morfogênese de ramificação no rim em desenvolvimento. Ao controlar programas transcricionais ligados à sinalização epitélio–mesenquimal e à diferenciação, o SIX2 influencia vias que governam decisões de destino celular, proliferação e padronização tecidual. Alterações na expressão de Six2 ou a desregulação de redes transcricionais da família SIX têm sido associadas a malformações renais congênitas e a distúrbios do desenvolvimento, tornando-o um alvo útil para o estudo de circuitos de regulação gênica em tecidos embrionários. Além disso, Six2 é amplamente utilizado como marcador e como nó funcional na biologia de células-tronco/progenitoras e em modelos de desenvolvimento renal.

Six2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Six2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Six2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Six2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Six2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Six2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Six2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Six2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Six2 em células tumorais com expressão de Six2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.