Siva CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403496-ACT

Human SIVA1 kodiert Siva, ein proapoptotisches Adapterprotein, das ursprünglich über seine Interaktion mit Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie identifiziert wurde und extrazelluläre Todessignale mit intrazellulären Signalwegen verknüpft. Siva ist an der Regulation der Apoptose und zellulärer Stressantworten beteiligt; beschrieben sind unter anderem Rollen bei der Modulation der NF-κB-Aktivität sowie bei der Integration von Signalen, die die mitochondriale Integrität und die Caspase-Aktivierung beeinflussen. Da SIVA1 Zellschicksalsentscheidungen und Überlebenswege mitprägt, wird die Dynamik der SIVA1-Expression häufig im Kontext onkogener Transformation, Tumorsuppressor-Netzwerke und immunbezogener Signalübertragung untersucht. Eine dysregulierte SIVA1/Siva-Aktivität wurde mit veränderter Empfindlichkeit gegenüber apoptotischen Stimuli sowie mit Veränderungen in Proliferation und DNA-Schadensantworten in Verbindung gebracht, was SIVA1 als mechanistischen Knotenpunkt in krankheitsrelevanten Modellen unterstützt.

Siva Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIVA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Siva Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIVA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIVA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Siva-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIVA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Siva-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Siva-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIVA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.