SHIP-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421137-ACT

Inpp5d codifica a SHIP-1 (fosfatase de inositol 5 contendo domínio SH2 1), uma fosfatase lipídica enriquecida em células hematopoéticas que hidrolisa o fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) em PI(3,4)P2, atenuando assim a sinalização dependente de PI3K. Ao contrabalançar o acúmulo de PIP3, a SHIP-1 modula a atividade a jusante de AKT/mTOR e influencia a sinalização de receptores imunes, incluindo receptores Fc, receptores de citocinas e receptores de antígeno. Em modelos murinos, a atividade da SHIP-1 está associada à regulação dos limiares de ativação de células mieloides e linfoides, da sinalização inflamatória e do controle homeostático da sobrevivência e diferenciação de células imunes. Vias desreguladas de INPP5D/SHIP-1 são amplamente relevantes para pesquisas sobre disfunção imune e fenótipos associados à inflamação, inclusive em contextos em que a sinalização de PI3K está alterada.

SHIP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Inpp5d sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SHIP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Inpp5d em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Inpp5d, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SHIP-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Inpp5d nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SHIP-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SHIP-1 em células tumorais com expressão de Inpp5d silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.