RoXaN CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411701-ACT

ZC3H7B kodiert RoXaN, ein zytoplasmatisches RNA-bindendes Protein, das über Interaktionen mit dem Poly(A)-Bindungsprotein und Komponenten von Messenger-Ribonukleoprotein-Komplexen an der posttranskriptionellen Genregulation beteiligt ist. RoXaN wird mit der Kontrolle der mRNA-Stabilität und der Translation in Verbindung gebracht und unterstützt damit die koordinierte Expression von Genen, die an zellulären Stressantworten und wachstumsassoziierten Programmen beteiligt sind. Berichtet wurden zudem Interaktionen mit viralen Faktoren, was auf eine Rolle an der Schnittstelle zwischen Wirt und Pathogen sowie bei der Regulation des RNA-Stoffwechsels während einer Infektion hinweist. Eine Fehlregulation RNA-bindender Proteine und von mRNA-Prozessierungswegen ist allgemein für die Krebsbiologie sowie für neurologische und immunologische Phänotypen relevant, wodurch ZC3H7B ein nützliches Ziel für mechanistische Studien zur Kontrolle der Genexpression darstellt.

RoXaN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ZC3H7B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RoXaN Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ZC3H7B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ZC3H7B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RoXaN-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ZC3H7B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RoXaN-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RoXaN-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ZC3H7B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.