RNH1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404619-ACT

A RNH1 humana (inibidor 1 de ribonuclease/angiogenina) codifica uma proteína com repetições ricas em leucina que se liga e inibe membros da superfamília RNase A, sobretudo a angiogenina (ANG), modulando assim o metabolismo de RNA e programas de adaptação ao stress. Ao limitar a atividade ribonucleolítica da ANG e o seu papel na clivagem de tRNA induzida por stress, a RNH1 influencia o controlo da tradução e respostas celulares mais amplas a estímulos oxidativos e inflamatórios. A RNH1 também tem sido associada à homeostase redox através de efeitos na suscetibilidade celular a espécies reativas de oxigénio e na sobrevivência sob stress. A desregulação da sinalização RNASE/ANG e de vias de RNA associadas ao stress é relevante para a neurodegeneração, a biologia do cancro e estados inflamatórios, tornando a RNH1 um ponto útil para estudos mecanísticos de fenótipos mediados por RNA.

RNH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNH1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RNH1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNH1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNH1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RNH1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNH1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RNH1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RNH1 em células tumorais com expressão de RNH1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.