RNF8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401909-ACT

RNF8 codifica uma ligase de ubiquitina E3 que atua como um amplificador precoce de sinalização na resposta a danos no DNA, catalisando a ubiquitinação em locais de quebras de dupla fita para coordenar o recrutamento de fatores de reparo. Por meio de interações com MDC1 e de ancoragem dependente de fosforilação na cromatina danificada, RNF8 promove a montagem, dependente de ubiquitina, de mediadores a jusante como 53BP1 e BRCA1, influenciando a escolha de via entre a junção de extremidades não homólogas e a recombinação homóloga. A atividade de RNF8 também conecta a vigilância do genoma ao controle de checkpoints do ciclo celular e ao remodelamento da cromatina, ajudando a manter a estabilidade genômica sob estresse de replicação. A sinalização desregulada de RNF8 tem sido associada a alterações na capacidade de reparo do DNA e a fenótipos de instabilidade genômica relevantes para a biologia do câncer e para a sensibilidade a agentes genotóxicos.

RNF8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RNF8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RNF8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RNF8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RNF8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RNF8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RNF8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RNF8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RNF8 em células tumorais com expressão de RNF8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.