RAGE CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-419040-ACT-2

Das Mausgen Ager kodiert den Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE), einen multiliganden Mustererkennungsrezeptor aus der Immunglobulin-Superfamilie, der AGEs, S100-Proteine, HMGB1 und amyloidassoziierte Liganden bindet, um zelluläre Stress-Signalwege zu verstärken. Die Aktivierung von RAGE fördert die NF-κB-abhängige Transkription, die Aktivierung der MAPK- und JAK/STAT-Signalwege, die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies sowie eine anhaltende Expression entzündungsbezogener Gene, die die Endothelaktivierung, die Rekrutierung von Leukozyten und den Gewebeumbau beeinflussen kann. In murinen Systemen wird die Ager/RAGE-Biologie häufig im Kontext metabolischer Entzündung, vaskulärer Dysfunktion, Neuroinflammation und fibroseassoziierter Prozesse untersucht, bei denen Ligandenakkumulation und chronische angeborene Immun-Signalgebung zusammenkommen. Die Geneditierung von Ager in Maus-Zellen oder -Modellen ermöglicht die mechanistische Aufschlüsselung ligandspezifischer Signalgebung, der Rezeptor-Wechselwirkungen mit Toll-like-Rezeptoren und nachgeschalteter Transkriptionsprogramme, die für Immun- und Barrieregewebe relevant sind.

RAGE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ager-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RAGE Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ager-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ager-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RAGE-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ager-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RAGE-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RAGE-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ager-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.