Rab GDI β Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404136-ACT

GDI2 codifica o inibidor beta da dissociação de GDP de Rab (Rab GDIβ), uma chaperona citosólica que se liga a Rab GTPases preniladas e controla a sua extração da membrana, reciclagem e entrega do citosol para a membrana. Ao regular os ciclos de ativação de Rab, a Rab GDIβ sustenta vias de tráfego vesicular essenciais para endocitose, exocitose e dinâmica de organelos, incluindo o transporte no Golgi e no sistema endossomal. Alterações na homeostase das Rab GTPases e no controlo do tráfego estão associadas a desregulação da sinalização de recetores, apresentação de antigénios e adaptação metabólica, processos frequentemente implicados na biologia do cancro e de doenças neurodegenerativas e inflamatórias. Como coordenador central da localização e disponibilidade de Rab, o GDI2 é frequentemente estudado para relacionar defeitos no tráfego de membranas com alterações a jusante na sinalização e no fenótipo celular.

Rab GDI β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GDI2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rab GDI β O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GDI2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GDI2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rab GDI β. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GDI2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rab GDI β no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rab GDI β em células tumorais com expressão de GDI2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.