PRP8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402819-ACT

PRPF8 kodiert PRP8, eine hochkonservierte Kernkomponente des U5-snRNP innerhalb des U2-Typ-Spleißosoms, wo es die Bildung des katalytischen Zentrums und die Exon-Ligation während des Prä‑mRNA-Spleißens mitkoordiniert. Durch seine umfangreichen Interaktionen mit spleißosomalen RNAs und Proteinen unterstützt PRP8 die Erkennung von Spleißstellen, die Dynamik der Spleißosomenassemblierung und die Integrität des Transkriptoms über vielfältige Genprogramme hinweg. Eine Störung der PRPF8-Funktion kann alternative Spleißmuster beeinträchtigen und zu weitreichenden Veränderungen der RNA-Prozessierung sowie nachgeschalteter Signalwege führen, die mit Zellzykluskontrolle, DNA-Schadensantworten und Proteostase verbunden sind. Abnorme Spleißosomenaktivität unter Beteiligung von PRPF8 wurde mit erblichen Netzhauterkrankungen in Verbindung gebracht und im Kontext einer in malignen Erkrankungen und anderen Krankheitsbildern mit veränderter RNA-Prozessierung beobachteten Spleißosomen-Fehlregulation untersucht.

PRP8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRPF8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PRP8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRPF8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRPF8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PRP8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRPF8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PRP8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PRP8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRPF8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.